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Synthèse et propriétés de monocristaux, de poudres, films minces ou hétérostructures

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Soutenance de thèse de Benoit KALMAN

Publié le 19 septembre 2016
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Soutenance 6 octobre 2016
14h00 - PHELMA - bâtiment Z 1er étage  - salle 108
Grenoble INP - Phelma
3 parvis Louis Néel - 38000 Grenoble
Accès : TRAM B arrêt Cité internationale
Free entrance - No registration

Génération et optimisation de microtissus musculaires 3D in vitro/Generation and optimisation of 3D muscle microtissue in vitro

KALMAN BENOIT.png

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Thèse de Benoit KALMAN
 
Mots-clés/Keywords ingénierie tissulaire, muscle squelettique, différenciation cellulaire, myoblaste, culture cellulaire 3D, coculture/tissue engineering, skeletal muscle, cellular differentiation, myoblast, 3D cell culture, coculture

Directeur de Thèse : Prof.Catherine PICART- LMGP - Grenoble INP - Grenoble - France - Co-encadrant Thomas BOUDOU - LMGP - CNRS - Grenoble - France 

cliquer pour voir la liste des membres du jury/click here to see the jury members


 

Résumé L’ingénierie du tissu musculaire squelettique vise à reconstituer in vitro un tissu fonctionnel aussi physiologique que possible dans le but de mieux comprendre la myogenèse, l’impact de mutations génétiques et tester des médicaments. Ces dernières années, différents modèles de tissus musculaires tridimensionnels ont été développés. Toutefois, l’utilisation prépondérante de cellules murines et la taille de ces modèles restreint leur pertinence pour les études de pathologies humaines et le criblage pharmacologique. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons donc développé différents modèles de tissus musculaires humains micrométriques pour répondre à ces limitations. Dans un premier temps, nous avons conçu et optimisé par microfabrication une plateforme caractérisée par la présence de microcanaux. Nous avons ainsi généré des tissus musculaires multicouches alignés présentant une organisation proche du muscle natif à partir de myoblastes murins immortalisés C2C12 puis de myoblastes humains immortalisés. Nous avons ainsi montré l’influence de la topographie et de la concentration cellulaire sur l’alignement des myotubes et la maturation du tissu musculaire. Dans un second temps, nous avons développé une plateforme constituée de micropuits contenant chacun deux micropiliers permettant d’analyser la contractilité des tissus. Des microtissus musculaires 3D standardisés ont ainsi été générés avec cette plateforme à partir de myoblastes murins, et de myoblastes C2C12 électroporés avec un gène muté ou non de la desmine. Par la suite, des microtissus ont été générés à partir de myoblastes humains. L’importance du choix de la matrice dans la formation des microtissus et les bénéfices d’une coculture de myoblastes et fibroblastes dans la stabilité des tissus ont ainsi été mis en évidence. La géométrie de micropiliers a aussi été optimisée afin de générer et comparer des microtissus composés de myoblastes isolés de patients sains et malades (dystrophie musculaire de Duchenne). Une preuve de concept démontrant la possibilité d’utiliser cette technologie pour tester des thérapies chimiques et géniques a été établie. Nous avons en effet suivi en temps réel les effets de l’inhibiteur de la kinase Rho-associée Y-27632 sur la contractilité des microtissus, ainsi que la transduction d’un gène rapporteur fluorescent modèle par les cellules composant les microtissus. Les résultats de ce travail de thèse démontrent le potentiel de cette technologie pour l’étude des processus fondamentaux de la myogenèse, l’évaluation des effets fonctionnels de mutations patient-spécifique et le criblage de thérapies chimiques et géniques.

Abstract Skeletal muscle tissue engineering aims to build functional and physiological tissues in vitro in order to better understand myogenesis, to investigate the impact of genetic mutations and to screen potential therapies. Over the past few years, bi- and tridimensional models of muscle tissue have been developed, but most of these models are based on the use of murine cells and require large amounts of cells, thus limiting their relevance to study pathologies of human muscles and drug screening assays. Here we aimed at developing different models of human muscle microtissues to address these issues. By using microfabrication techniques, we first engineered a microgrooved platform we used to generate aligned multilayered skeletal muscle tissues from murine C2C12 myoblasts and human immortalized myoblasts. We showed the impact of topography and cell density on the maturation and myotube alignment. We then fabricated a microdevice, consisting of microwells containing two micropillars allowing an easy access to the contractility of muscle tissues. We engineered microtissues from C2C12 and C2C12 myoblasts electroporated with a mutated gene of desmin, and showed some limitation of this technique of transduction. Finally, we generated microtissues from human myoblasts. We investigated the role of the extracellular matrix in the tissue formation and evidenced the benefits of coculturing myoblasts and fibroblasts on the stability of muscle microtissues. Furthermore, we optimized the geometry of the micropillars to engineer and compare microtissues composed of human myoblasts isolated from healthy and diseased (Duchenne muscular dystrophy) patients. A proof of concept of the potential of this technology for screening chemical and gene therapies was established. We were indeed able to analyze in real time the effects of the Rho-associated kinase-inhibitor Y-27632 on the tissue contractility, as well as the transduction of a model fluorescent reporter gene. Altogether, the results of this work demonstrate the potential of this technology to study fundamental muscle biology, examine functional effects of patient-specific mutations or screen chemical and gene therapies.

 

Membres du jury/ jury members :

Dr.Florence Ruggiero - ENS Lyon CNRS UMR5242 46, allée d'Italie 69364 Lyon cedex 07 - France - Examinateur
Dr.Nathalie Picollet D'Hahan - CEA - BIOMICS LBGE/INSERM U1038 17 rue des Martyrs 38054 Grenoble Cedex 09 - Examinateur
Dr.Sylvain Gabriele - University of Mons Research Institute for Biosciences CIRMAP -Mechanobiology & Soft Matter Group Interfaces and Complex Fluids Laboratory 20 Place du Parc B-7000 Mons BELGIQUE  - Rapporteur
Dr.Catherine Coirault - Institut de Myologie Inserm U974 UPMC Univ Paris 06 UM76 IFR14 - CNRS UMR7215 47 bld de l’Hôpital, GH Pitié-Salpétrière, 75013 Paris FRANCE  - Rapporteur
Dr.Thomas Boudou - LMGP - CNRS 3 Parvis Louis Néel 38016 Grenoble FRANCE  - Co-Encadrant
Prof.Catherine Picart - LMGP - Grenoble INP -3 Parvis Louis Néel 38016 Grenoble France - Directeur de Thèse

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Rédigé par Michele San Martin

mise à jour le 16 mars 2017

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Communauté Université Grenoble Alpes